G家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 30972411)資助的課題
*通訊作者。Tel: 010-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
Received: November 3, 2012   Accepted: January 5, 2013
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.30972411)
*Corresponding author. Tel: +86-10-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
 
 
超低溫保存(cryopreservation)是指將生物材料活體, 采取一定的技術(shù), 存入–80 ℃以下的低溫保存(通常為液氮–196 ℃), 需要時采取一定的方法使之回到常溫并正常生長的一整套生物技術(shù)。由于在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及食品等相關(guān)*域有著廣泛的應(yīng)用前景, 超低溫保存已成為近年來低溫生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一^[1]。近年來, 超低溫保存的技術(shù)研究已趨于成熟, 除了基于低溫脫水的傳統(tǒng)的超低溫保存技術(shù)外, 新興的基于細(xì)胞內(nèi)部溶質(zhì)玻璃化的超低溫保存技術(shù)的發(fā)展, 極大地?cái)U(kuò)充了超低溫保存的應(yīng)用范圍^[2]。超低溫保存技術(shù)的發(fā)展依賴于其機(jī)制的解答, 而機(jī)制的解答也會起到指導(dǎo)超低溫保存技術(shù)發(fā)展的作用。但是, 就目前的現(xiàn)狀而言, 超低溫保存的機(jī)制研究相對滯后, 這也在一定程度上限制了超低溫保存技術(shù)應(yīng)用范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大。
近年來的研究發(fā)現(xiàn), 在超低溫保存中往往伴隨著氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象, 這些現(xiàn)象是否與超低溫保存密切相關(guān), 是否會影響超低溫保存的效果, 是否可以作為改進(jìn)超低溫保存技術(shù)的依據(jù), 這些問題也逐漸得到了研究者的關(guān)注。本文對近二十年來超低溫保存中與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象相關(guān)的研究做出綜述, 以期為推進(jìn)超低溫保存技術(shù)的進(jìn)步提供理論依據(jù)。

1 超低溫保存中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象

氧化應(yīng)激是指由于活性氧(reactive oxygen species, ROS)過度產(chǎn)生和抗氧化防御機(jī)制減弱, 導(dǎo)致活性氧的生成和清除之間的平衡失調(diào), 過量的活性氧引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷^[3-7]。諸多的研究發(fā)現(xiàn), 超低溫保存往往伴隨著生物材料中活性氧水平的升高, 而過多的活性氧引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致生物材料超低溫保存損傷的重要原因之一。理論表明, 當(dāng)活性氧的生成量大于細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)水平時, 過多的活性氧就會攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或核酸等大分子, 通過去除電子的方式, 促使其結(jié)構(gòu)的修改和功能的改變, 從而導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化、蛋白質(zhì)的變性以及DNA或 RNA的損傷^[8-10]。
Baumber^[11]對馬精子的超低溫保存研究發(fā)現(xiàn), 高水平活性氧的生成會增加DNA的片段化和減少谷胱甘肽的生成量, 并認(rèn)為活性氧可能與精子獲能的信號通路相關(guān)。這與Meseguer等^[12]的發(fā)現(xiàn)存在一定的一致性——谷胱甘肽過氧化物酶1和4的表達(dá)水平及活性、谷胱甘肽濃度與人類精子超低溫保存后的恢復(fù)速率相關(guān),。Li等^[13]同樣在人類精子的超低溫保存中發(fā)現(xiàn), 保存后活性氧的生成量顯著上升, 并且與凍融后精子的生存力和運(yùn)動性下降等變化呈現(xiàn)出相關(guān)性, 因此認(rèn)為超低溫保存后精子質(zhì)量的下降可能是由氧化應(yīng)激所造成的。Zribi等^[14]在人類精子的超低溫保存中也發(fā)現(xiàn)了保存后精子的DNA片段化和氧化率顯著增加的現(xiàn)象, 但并未對其產(chǎn)生機(jī)制做出解釋。Thomson等^[15]以8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)作為生物標(biāo)記, 證明了超低溫保存引起的人類精子DNA片段化與氧化應(yīng)激相關(guān)。
生物材料中活性氧的種類包括了激活的單電子氧(¹O₂)、超氧陰離子自由基(·O₂^–)、過氧化氫(H₂O₂)和羥基自由基(·OH)等^[16]。目前的研究顯示, 與超低溫保存相關(guān)的氧化應(yīng)激可能是由羥基自由基所主導(dǎo)的。Fang等^[16]在研究中發(fā)現(xiàn), 超低溫保存后伴隨著可可體細(xì)胞胚的恢復(fù), 羥基自由基產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔?mdash;—甲烷, 呈現(xiàn)出一定的周期性變化規(guī)律。更確鑿的證據(jù)來自于Góes等^[10]的研究, 他們將超低溫保存后的山羊精子培養(yǎng)在4種不同的活性氧誘導(dǎo)機(jī)制下(分別產(chǎn)生激活的單電子氧、超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥基自由基), 精子對羥基自由基顯示出了高敏感性。
為了減少或消除氧化應(yīng)激的影響, 抗氧化劑在超低溫保存中得到了廣泛的應(yīng)用。抗氧化劑可以轉(zhuǎn)換活性氧, 防止其過剩, 從而**大限度地提高超低溫保存后細(xì)胞的存活率^[17]。在眾多的抗氧化劑中, 過氧化氫酶經(jīng)常作為冷凍和熔融過程中的添加劑使用。研究表明, 添加過氧化氫酶可以顯著減少超低溫保存后人類精子^[13]和馬精子^[11]的活性氧的生成量, 提高家貓精子的運(yùn)動性和前向性^[8], 并改善人類造血干細(xì)胞的粘附性和與遷移有關(guān)的屬性等^[18]。此外, 過氧化物歧化酶^[8]、依達(dá)拉奉^[19]、維他命E、維他命C、谷胱甘肽、硫辛酸、甜菜堿^[9]、抗壞血酸^[13]、蛋氨酸、肌醇、肉堿^[20]等物質(zhì)也被作為抗氧化劑應(yīng)用于超低溫保存中。**新的研究還顯示, 精漿對于解凍后馬精子^[11]和山羊精子^[10]的恢復(fù)更為有效: 而血小板裂解物對超低溫保存后人類肝臟細(xì)胞代謝功能的恢復(fù)更為有效^[21]。這可能同樣是與精漿和血小板裂解物中含有抗氧化性的物質(zhì)相關(guān)。
此外, 針對細(xì)胞膜的研究顯示, 超低溫保存會造成細(xì)胞膜的大范圍破壞, 因此往往將細(xì)胞膜的完整性作為成功的超低溫保存的**低標(biāo)準(zhǔn)^[22]。如前所述, 氧化應(yīng)激是造成超低溫保存中生物材料損傷的重要原因之一。活性氧很容易氧化膜脂上的不飽和脂肪酸。脂質(zhì)的過氧化一方面改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能, 例如通透性的升高, 另一方面它會導(dǎo)致二次脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如醛的生成, 而醛分解后的丙二醛(MDA)又會與蛋白質(zhì)、酶類和DNA鏈接, 進(jìn)一步導(dǎo)致潛在的誘變^{[9, 16, 17]}。
Martinez等^[23]在甘蔗胚性愈傷組織超低溫保存后的第2天觀察到了電導(dǎo)率的升高。尚曉倩^[24]在芍藥花粉的超低溫保存中觀察到電導(dǎo)率隨保存時間延長持續(xù)上升: 而李廣清^[25]在山茶花粉的超低溫保存中發(fā)現(xiàn)花粉電導(dǎo)率是前期升高, 后期有出現(xiàn)下降趨勢, 但仍高于對照。這些研究都說明超低溫保存確實(shí)在一定程度上對細(xì)胞膜造成了損傷, 從而導(dǎo)致了細(xì)胞外電解質(zhì)滲透液的增加。除了使用電導(dǎo)率作為細(xì)胞膜通透性的參數(shù)外, 脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)也被用來作為檢驗(yàn)超低溫保存效果的指標(biāo)。超低溫保存后, 山茶花粉^[25]、蠟梅花粉^[26]、木薯莖尖^[27]、羅氏沼蝦胚胎^[28]、留蘭香莖尖^[29]等的MDA含量均顯著升高。超低溫保存中氧化應(yīng)激及外源抗氧化劑關(guān)系的研究進(jìn)展見圖1。
 
圖1  超低溫保存中氧化應(yīng)激及外源抗氧化劑作用
Fig.1  Effect of antioxidants to the pro-oxidant/antioxidant balance in the cryopreservation
 
除了以上脂質(zhì)過氧化的間接證據(jù)外, 研究者還證明了超低溫保存對細(xì)胞膜脂類成分變化的直接影響。Blesbois等^[30]發(fā)現(xiàn)超低溫保存導(dǎo)致火雞和珍珠雞精子的細(xì)胞膜膽固醇/磷脂的比例顯著下降, 并認(rèn)為這種變化降低了細(xì)胞膜的流動性。Chakrabarty等^[31]在山羊精子的超低溫保存中發(fā)現(xiàn), 總脂及其組成成分的中性脂肪、糖脂和磷脂在超低溫保存后下降明顯, 其中與磷脂相關(guān)的不飽和脂肪酸比例變小, 而飽和脂肪酸比例上升, 因而認(rèn)為山羊精子應(yīng)對超低溫?fù)p傷的主要機(jī)制是通過優(yōu)先脫落細(xì)胞膜中親水性的脂質(zhì)成分而增加細(xì)胞膜的疏水性進(jìn)行的。Odintsova等^[32]對海洋無脊椎動物幼蟲細(xì)胞的研究顯示, 超低溫保存極大地影響了細(xì)胞膜脂肪酸的飽和度、單烯度和多烯度, 并且這種變化因保存的細(xì)胞來源和使用的冷凍保護(hù)劑而存在差異。
鑒于以上研究, 相應(yīng)的細(xì)胞膜保護(hù)措施也被應(yīng)用于超低溫保存中, 其中通過一定的方式來增加膽固醇和不飽和脂肪酸的含量是采取的主要方式。已證明, 外援膽固醇的添加可以顯著改善牛精子^[33]和馬精子^[34]超低溫保存后的存活率: 而Ω-3脂肪酸可以顯著提高超低溫保存后不飽和脂肪酸的含量^[35]。此外, 還有研究發(fā)現(xiàn), 蔗糖的預(yù)培養(yǎng)可以使香蕉懸浮細(xì)胞超低溫保存后豆甾醇/甾醇的比例, 總脂肪酸中的中性脂質(zhì)、糖脂和鞘脂的成分以及游離脂肪酸酸含量顯著增高, 并使中性脂肪的雙鍵指數(shù)增加以及糖脂和鞘脂、磷脂和游離脂肪酸的雙鍵的減少, 并提高了超低溫保存后的存活率^[36]。而利用毛猴素進(jìn)行化學(xué)去脂, 可以顯著提高貓胚胎超低溫保存后的存活率、桑椹胚和胚泡的形成率^[37]。這些保護(hù)措施可能都與改變細(xì)胞膜脂類成分的含量相關(guān)。

2 超低溫保存中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

超低溫保存造成的細(xì)胞死亡主要有以下三種類型: 細(xì)胞破裂(與冰晶生成有關(guān))、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡^[38]。部分研究發(fā)現(xiàn), 超低溫保存造成的細(xì)胞死亡具有遲發(fā)性, 進(jìn)一步研究遲發(fā)性死亡的背后機(jī)制顯示, 這種死亡主要是由細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡這兩種途徑所造成的^[39]。其中, 區(qū)別于細(xì)胞壞死的被動過程, 細(xì)胞凋亡作為一種與能量相關(guān)的, 由基因控制的細(xì)胞**、有序的死亡方式, 得到了超低溫保存機(jī)制研究者的廣泛關(guān)注。
細(xì)胞凋亡通常會采用半胱氨酸蛋白酶活力、磷脂酰絲氨酸的外化、線粒體膜電位的改變和DNA片段化等參數(shù)進(jìn)行檢測^[40]。Paasch等^[41]比較了超低溫保存對人類精子細(xì)胞凋亡參數(shù)的影響, 發(fā)現(xiàn)超低溫保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活性顯著上升, 線粒體膜電位下降, 但DNA片段不存在顯著變化。Martin等^[42-43]同樣在超低溫保存后的牛精子中發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位的降低、半胱氨酸蛋白酶活性和細(xì)胞膜通透性升高等現(xiàn)象, 并檢測到了細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子這兩種伴隨細(xì)胞凋亡的蛋白的產(chǎn)生, 但沒有發(fā)現(xiàn)DNA片段化和細(xì)胞核濃縮的顯著變化。Vogel^[44]通過免疫印跡技術(shù)比較了人類真皮的成纖維細(xì)胞中線粒體蛋白質(zhì)Bcl-XL和Bax的比值(這兩種蛋白的比值代表了細(xì)胞凋亡正向和負(fù)向的比例), 發(fā)現(xiàn)在超低溫保存復(fù)溫后比值略有升高, 在之后的6小時和12小時顯著上升, 直到24小時才恢復(fù)到與對照相當(dāng)?shù)乃健iu等^[45]在比較超低溫保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因組時, 發(fā)現(xiàn)超低溫保存誘導(dǎo)了凋亡基因Fas和Fas配體的表達(dá)。Park等^[46]同樣證明了凍融過程引起了牛囊胚細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的生存素、Fas、熱休克蛋白70和半胱氨酸蛋白酶-3基因表達(dá)量的增加。
以上研究在證明超低溫保存與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性之外, 也為如何減輕或消除細(xì)胞凋亡的影響指明了道路。半胱氨酸蛋白酶抑制劑已被證明在豬肝細(xì)胞超低溫保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活性、減少線粒體中細(xì)胞色素C的釋放, 減慢線粒體膜電位的下降速度, 并使肝細(xì)胞活力的功能指標(biāo)——白蛋白產(chǎn)量、地西泮的代謝和尿素產(chǎn)量顯著增加^[47]。而在大鼠的肝細(xì)胞超低溫保存中, 添加半胱氨酸蛋白酶抑制劑則顯著改善了復(fù)溫后6小時和24小時的肝細(xì)胞的分化能力和功能^[48]。
氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡作為近年來超低溫保存中生理現(xiàn)象的兩大研究熱點(diǎn), 其本身也存在著千絲萬縷的聯(lián)系。研究表明, 超低溫保存中出現(xiàn)的氧化應(yīng)激不僅可以直接造成細(xì)胞損傷, 也可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡, 如活性氧活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B, NF-kB), 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡; 或通過作用于線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡; 活性氧導(dǎo)致DNA損傷, 激活P53, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等^[49]。
圖2所示線粒體產(chǎn)生的活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡, 可以在一定程度上反映超低溫保存中細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
 
圖2  由線粒體產(chǎn)生的活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡示意圖(根據(jù)參考文獻(xiàn)[50]修改)
Fig.2   Schematic representation of apoptosis which is mediated by ROS generated by mitochondria(modified from reference [50])

3 結(jié)語和展望

超低溫保存中有關(guān)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象的研究還處于起步階段, 本質(zhì)的揭示尚需要大量的實(shí)驗(yàn)支持。對超低溫保存中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡這兩大生理現(xiàn)象廣泛和深入研究, 不僅對揭示超低溫保存機(jī)制有重要的理論意義, 也將為超低溫保存技術(shù)發(fā)展提供一條新的思路。
圍繞該研究方向, 未來的超低溫保存研究將集中在超低溫保存技術(shù)中探索更多的抗氧化劑(包括酶類和非酶類)的使用效果, 從而開發(fā)新型的保護(hù)劑; 超低溫保存的技術(shù)策略也會更多通過防止細(xì)胞膜氧化, 而不是僅僅關(guān)注冰晶對細(xì)胞膜的傷害展開; 超低溫引起細(xì)胞凋亡的信號途徑及其阻斷技術(shù)也會得到深入的研究, 從而提高超低溫保存材料的成活率。
 
 

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